一、菌落染色法
在含有氧化還原顯,色試劑四唑嗡紫羅蘭等的瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)微生物,或者在普通的瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)后,經(jīng)過染色,很容易判別菌落是一種比標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)時間更短的計測菌落的方法。
微觀染色用于對培養(yǎng)結(jié)束的膜過濾器直接滴下染色液,然后讓其干燥,將染成青色的菌落拿到10~20倍的放大鏡下進(jìn)行計測。培養(yǎng)時間可以縮短到原來方法的1/4~1/2。
二、阻抗法
微生物在增殖過程中會將蛋白質(zhì)、碳水化合物等高分子化合物,分解成有機(jī)酸、氨基酸等離子化合物,這些離子化合物達(dá)到一定濃度,在周圍環(huán)境中將產(chǎn)生微小的電量變化。將這個電量的變化利用電阻、導(dǎo)電性或者靜電容量這些概念檢測的方法,稱為阻抗法。產(chǎn)生電量與開始時的細(xì)菌數(shù)、菌的增殖性成反比。因此,從預(yù)先求得的兩者的標(biāo)準(zhǔn)曲線中可以推算出樣品中初始的細(xì)菌數(shù)。作為產(chǎn)品化的系統(tǒng)有氣壓(或液壓)傳輸系統(tǒng)以及細(xì)菌計數(shù)器。
實際操作如下:往容器中添加液體培養(yǎng)基和樣品,放在組成系統(tǒng)的培養(yǎng)裝置中開始培養(yǎng)。測定機(jī)逐時的自動監(jiān)測培養(yǎng)過程中電量的變化。
本測定方法必須培養(yǎng),但它和原來計測菌落的方法相比,優(yōu)點在于培養(yǎng)時間可以縮短。培養(yǎng)開始后直到結(jié)果的打印輸出*自動化,初始投資高但運(yùn)行費(fèi)用低。另外,通過組合選擇性培養(yǎng)基,可應(yīng)用于檢測特定微生物。
三、氧化電極法
氧化電極法是一種將微生物增殖過程中的呼吸活性通過氧化電極檢出的方法。與阻抗法一樣,通過自動監(jiān)測,逐時的測定隨培養(yǎng)進(jìn)度而產(chǎn)生的培養(yǎng)基中溶解氧的濃度,直到能夠檢出呼吸活性的培養(yǎng)時間,從這一時間推算樣品中的開始菌數(shù)。測定時,向裝有氧化極的容器中添加液體培養(yǎng)基和樣品,然后放在組成系統(tǒng)的培養(yǎng)裝置中開始培養(yǎng),測定機(jī)自動監(jiān)測培養(yǎng)基中溶解氧濃度的逐時變化。6h內(nèi)就可以檢出105CFU/g的開始菌數(shù)。
四、顯色法
顯色法是一種通過標(biāo)識色素的色調(diào)變化來檢測隨微生物代謝產(chǎn)生的培養(yǎng)基pH值的變化和CO2生成的方法。通過自動監(jiān)測檢測出培養(yǎng)過程中標(biāo)識色素的色調(diào)變化,從直到可以檢測出色調(diào)變化的這一段培養(yǎng)時間推算出樣品中的開始菌數(shù)。以培養(yǎng)基pH值變化為指標(biāo)的維夫斯、以CO2生成為指標(biāo)的敏化培養(yǎng)基/生物材料20都已產(chǎn)品化。
維夫斯使用容器,此容器中盛有包含標(biāo)識色素的瓊脂層與液體培養(yǎng)基。使用時,向容器中添加樣品,放入組成系統(tǒng)的培養(yǎng)裝置中開始培養(yǎng)。檢出時間受開始菌數(shù)多少的影響,但如果達(dá)到106CFU,7個小時就可以檢出。通過組合選擇性培養(yǎng)基,也可應(yīng)用于特定微生物的檢出。
以上四種方法仍需培養(yǎng),只是培養(yǎng)時間較傳統(tǒng)方式縮短,有助于改善生物污染控制的工作效率,屬于一類。以下幾種方法則無需培養(yǎng),屬于另一類環(huán)境微生物快速測定法。
五、熒光染色法
利用熒光染色劑熒光染色細(xì)胞膜和細(xì)胞核等,使用熒光顯微鏡等將細(xì)菌檢出的方法。染色機(jī)理不同的多種熒光染色劑,根據(jù)不同的組合也能識別出活菌和死菌。染色掃描RDI及D計數(shù)、真菌監(jiān)視器掃描、生物絮凝等都已產(chǎn)品化。
染色掃描RDI在薄膜過濾器上過濾樣品,熒光染色阻擋在薄膜過濾器上的微生物后,再進(jìn)行激光掃描。熒光染色的30min,激光掃描3min即可結(jié)束。其結(jié)果可以作為圖像表示在監(jiān)測器畫面上,也可以自動計測產(chǎn)生熒光的點數(shù)。D計數(shù)以及真菌監(jiān)視器掃描是結(jié)合了熒光染色法與流體檢查計數(shù)法的方法,可以連續(xù)測定液態(tài)樣品。
六、LAL試驗法
LAL試驗法是利用鱟屬的血球抽出物,檢測來源于革蘭氏陰性菌的內(nèi)毒素的方法。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁成分的脂多糖,可以作為革蘭氏陰性菌的指標(biāo)。
七、SLP試驗法
SLP試驗法是利用蠶血液成分檢出肽聚糖及β-葡聚糖的方法。肽聚糖是細(xì)菌的細(xì)胞壁成本,β-葡聚糖是真菌的細(xì)胞壁成分。因此,通過本試驗法能夠檢出這些微生物。不過,每個微生物的肽聚糖及β-葡聚糖含量因菌株不同而差異很大,與LAL試驗法一樣,不能定量微生物,而且也不能識別出式來源于活菌還是死菌。
八、ATP快速測定法
ATP是高能磷酸化合物,分解時產(chǎn)生的能量用于細(xì)胞內(nèi)各種有能量需求的反應(yīng)。即ATP在地球上所有活著的細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著類似于電池的功能,它的存在成為生命活動的證據(jù)。
(1)ATP法的測定原理
ATP法是利用螢火蟲尾部發(fā)光反應(yīng)的微生物測定法。來源于螢火蟲的熒光素酶催化反應(yīng),以高量子收獲率變換具有ATP的化學(xué)能源而發(fā)光。反應(yīng)結(jié)果產(chǎn)生的光的數(shù)量即發(fā)光量和ATP量成正比,通過測定發(fā)光量就可以定量ATP。ATP不但存在于細(xì)菌體內(nèi),而且廣泛存在游離于細(xì)菌體外的狀態(tài)。細(xì)菌外ATP是指從活細(xì)菌中溶析出來,細(xì)菌死時被逐出,而且被包含在有機(jī)污染中。細(xì)菌外ATP影響活菌數(shù)的測定,因此在前處理階段必須除去。另一方面,驗證潔凈度時,用細(xì)菌內(nèi)外ATP量的總和(ATP總量)為污染指標(biāo)的方法,在能夠檢出微生物及其溫床污染兩個方面的意義上是合理的。ATP法操作簡單且能快速得到結(jié)果。
(2)以菌體內(nèi)ATP量為指標(biāo)測定活菌數(shù)
根據(jù)ATP法求活菌數(shù)時,在前處理階段必須除去細(xì)菌體外的ATP。除去ATP的方法有酶化分解消去法和薄膜過濾器過濾除去法。酶化法原則上能適用于各種樣品,但含有高濃度的蛋白質(zhì)和脂肪的樣品,有時不能充分除去細(xì)菌體外的ATP,測試前必須確認(rèn)去除效果。而薄膜過濾器法不能用于引起堵塞的樣品,但它不僅可以除去細(xì)菌外的ATP,而且還可以除去妨礙發(fā)光反應(yīng)的物質(zhì),進(jìn)而使微生物濃縮,有助于測試。
(3)空氣中浮游菌數(shù)的測定
用空氣取樣器將空氣中浮游菌捕集到瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)之前,與原來方法相同。原來方法是培養(yǎng)2天后計測出現(xiàn)的菌落,與此相對,利用ATP法檢測細(xì)菌成功的將培養(yǎng)時間縮短到6h。
根據(jù)NASA標(biāo)準(zhǔn),在ISO 8級食品廠的潔凈室,取樣空氣量為10ft3的條件下,探討與原來方法的相關(guān)性。兩測定值具有相關(guān)性,但其相關(guān)性很小,只能推算出大致的空氣中浮游菌數(shù)。一般認(rèn)為這是由于多種微生物浮游于空氣中,各種微生物增殖速度和ATP含量不同的緣故。但是,雖不能準(zhǔn)確求出細(xì)菌數(shù),也可用于判定級別等某種程度上放寬范圍的評價。